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论文标题：（新引物可显著提高在土壤线虫群落宏条形码的鉴定效果）

期刊：

作者：Yincai Ren, Dorota L. Porazinska, Quanhui Ma, Shuhan Liu, Hongmei Li, Xue Qing

发表时间：06 sep 2023

DOI：

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本研究设计并测试了线虫线粒体宏条形码引物COIFGED。通过单头虫样本以及对人工模拟线虫群落进行测试，结果表明，新设计的引物COIFGED/JB5GED的能够显著提高鉴定物种的覆盖度与扩增效率，优于四种常用的COX1引物（JB3/JB4.5、JB3/JB5GED、COIF/COIR）；对线虫群落分析表明，该引物优于COX1常用引物JB3/JB4.5，但注释出的种类不及传统18S，这主要是因为数据库中相关参考序列缺失。通过COX1数据库的构建与注释技术提升，该基因在近缘种群宏条形码鉴定上具有一定潜力。

图1：线粒体引物COIFGED/JB5GED单头虫扩增效率测试

图2：不同宏条形码引物扩增子测序稀疏曲线（A）与注释物种多样性比较（B）

线虫在土壤生态系统中发挥着重要作用，同时也是土壤健康的重要指示物。由于土壤线虫个体小，种类繁多，且缺乏直观的鉴定特征，线虫的鉴定耗时耗力，实践操作中极为困难。传统的形态学鉴定专业性强，随着全球线虫分类学研究者数量的急速下降，线虫鉴定已成为土壤生态学相关研究的重要制约因素之一。DNA条形码技术不依赖形态学特征，具有操作简单、稳定性好的特点，已被广泛应用于多种生物种类的鉴定中。DNA条形码与高通量测序结合形成宏条形码技术（metabarcoding），该技术对混合种群进行DNA提取，通过对核糖体RNA或线粒体基因片段进行扩增子测序，能够一次性获得土壤中大量个体的鉴定信息，具有广阔的前景。现有的DNA条形码与宏条形码技术主要依赖核糖体18S基因，特别是NF1/18Sr2b引物。但该基因较为保守，难以区分近缘物种，实践中容易低估线虫群落的多样性。线粒体COXI基因种间差异大，种类特异性强，是昆虫等多种动物分子鉴定的重要靶标基因。相比其他动物，线虫COXI基因引物结合位点保守性差，导致引物设计困难。目前应用较多的JB3/JB4.5引物仅能扩增极少数类群，且扩增效果不稳定，阻碍了线虫的分子鉴定。

图3：不同宏条形码引物注释准确度测试

图4：不同宏条形码引物获得的属级别注释结果比较

针对线粒体COXI宏条形码技术中引物选择的困难，本研究设计并测试了高兼并引物COIFGED。结果显示，该引物对COIFGED/JB5GED在线虫鉴定数量和PCR产物质量上优于其他四种常用COXI引物（JB3/JB4.5、JB3/JB5GED、COIF/COIR）。在模拟线虫群落分析中，与COXI引物（JB3/JB4.5）和18S引物（NF1/18Sr2b）相比，新引物的测序饱和阈值及ASV的α多样性更高。模拟线虫群落中25个属，兼并引物的正向和反向分别可鉴定到12和14个属，优于引物JB3/JB4.5，但劣于18S引物（23个属）。进一步研究发现，通过构建系统进化树，该引物可多鉴定7种线虫，使鉴定到的线虫种类更接近18S鉴定结果。这一结果说明，现有GenBank数据库中COXI序列缺乏，造成部分线虫序列无法直接注释鉴定，从而影响了COXI宏条形码的鉴定效率。因此，本研究提出，COXI宏条形码技术在物种检测灵敏度上优于传统18S宏条形码，在近缘种群区分上具有明显优势。未来COXI宏条形码技术应配合相应数据库的建设，才能进一步提升线粒体宏条形码鉴定效率。

作者及团队介绍

任银彩（第一作者），南京农业大学2023级博士研究生，研究方向为土壤线虫群落与微生物互作。

李红梅（共同作者），南京农业大学植物保护学院教授，主要从事植物寄生线虫分类鉴定与生态学研究。

薛清（通讯作者），南京农业大学植物保护学院副教授，主要从事线虫分类鉴定、群体遗传学及线虫群落宏组学相关研究。

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期刊简介

Soil Ecology Letters(SEL) 由高等教育出版社与明升官网明升体育app院城市环境研究所共同主办，SpringerNature海外发行。报道领域包括：土壤生物多样性、土壤互营和食物网、土壤微生物组、土壤—植物相互作用、土壤生物地球明升手机循环、土壤生物修复和恢复、土壤多功能性、土壤生物对环境变化的响应和适应、土壤生态过程的突破性技术、新理论和模型。栏目包括但不限于：letter to editor, perspective, review, rapid report, research article, commentary, SEL digest。

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